梯度PCR仪常见问题的主要解决方案人人捕鱼官方网站

　　梯度PCR仪常见问题的主要解决方案：

　　1.梯度PCR仪在产物序列中引入了错误

　　这是由于聚合酶忠实性低或者循环数太多，这时需要使用带有校正活性的热稳定聚合酶，同时降低循环数。此外，四种dNTP的浓度不同也会出现该问题，此时应制备新的浓度相同的dNTP混合物。

　　2.PCR跑胶

　　该现象表现为目的条带很亮，但是边沿不清楚，前后有拖尾现象。出现这样的问题，则需要进行细致的分析，因为引起该问题的可能很多。可先检查是否模板质量问题，如有降解等，模板应避免反复冻融。也有可能是抽提RNA时有污染，则需要重新抽提RNA。此外，也可能是非特异性扩增引发该问题，可提高退火温度，少循环次数。电泳缓冲液时间太长，ph值和盐离子浓度明显改变、电泳时电压太高、电泳液过久没换，电泳胶脏了等都可能引发该问题。如果不是由上述原因引起，则进一步检查加样量是否过大，制胶过程中胶孔是否制好，EB是否冲洗干净、模板中是否混有基因组DNA或蛋白等。也需考虑是否扩增的条件不合适。针对具体原因再采取相应的措施。

　　3.对梯度PCR仪产物需要用凝胶纯化的时间掌控

　　当凝胶分析扩增产物只有一条带时，则无需使用凝胶纯化；

　　当可见其他杂带时，则可能是积累了大量引物的二聚体，在克隆前需要做凝胶纯化。